1962年，读高中时主演了浦山桐郎导演的剧情片《化铁炉林立的街》，因在片中饰演清新纯洁、品学兼优的少女，从此声名日盛，被影迷们亲切地称呼为小百合花；同年，与桥幸夫二重唱的歌曲《いつでも梦を》（《永怀梦想》），销量达30万张，并获得第4届日本唱片大奖。
1963年，主演根据川端康成早期中篇同名小说改编的爱情片《伊豆的舞女》，在片中饰演伶俐清秀的年轻舞女薰。
1965年，吉永小百合考入早稻田大学第二文学部史学科，在就学之时继续从事电影拍摄。1964年，与浜田光夫合作主演剧情片《凝视爱与死》，在片中饰演身患绝症的年轻女子大岛智子。
1969年，吉永小百合大学毕业，银幕形象开始由少女转变为成熟女性。1970年，与田中绢代、栗原小卷等演员合作出演大河剧《最后的枞树》播出，她在剧中饰演哑女宇乃。1972年，参演山田洋次执导的喜剧片《寅次郎的故事9：柴又恋情》。1974年，参演喜剧片《寅次郎的故事13：寅次郎失恋记》。
1975年，吉永小百合与仲代达矢一同出演浦山桐郎执导的文艺片《青春之门》，她一改往日清纯的少女形象，在片中饰演烧炭工的妻子阿妙。
1978年，参演山本萨夫执导的悬疑战争片《皇帝不在的八月》。1980年，与高仓健、田中邦卫合作出演战争片《动乱》。1982年，由森谷司郎执导的剧情片《海峡》上映，吉永小百合与高仓健在片中饰演夫妻。
1983年，由市川昆执导的爱情片《细雪》上映，吉永小百合与岸惠子、佐久间良子等人合作出演，片中饰演性情细腻而含蓄的雪子，该片改编自谷崎润一郎所著同名小说，讲述了大阪船场旧式家庭四姐妹的生活爱情故事。
1984年，主演根据真实事件改编的剧情片《天国车站》，在片中饰演因为感情问题先后杀死自己两任丈夫的林叶加代；同年，主演市川昆执导的爱情古装片《阿娴》，获得第8届日本电影学院奖最佳女主角奖。1985年，由浦山桐郎执导的剧情片《梦千代日记》上映，吉永小百合在片中饰演因原子弹辐射感染罹患白血病的艺伎馆老板梦千代。
1987年，主演的传记片《映画女优》上映，小百合在片中饰演与家人一起离开关西来到东京，立志要成为一名女演员的田中绢代，她凭着该角色提名第11届日本电影学院奖最佳女主角。
1988年，由市川昆执导的历史奇幻片《鹤》上映，小百合在片中饰演化身成女孩与男主相遇的白鹤；10月1日，与松田优作合作主演的剧情片《华之乱》上映，她在片中饰演近代著名女诗人与谢野晶子。1989年，凭借电影《鹤》和《华之乱》获得第12届日本电影学院奖最佳女主角奖。
1993年，主演的剧情片《梦中的女人》（《梦の女》）上映，片中饰演昭和年间落难的武士之女花魁枫，她凭着该片提名第17届日本电影学院奖最佳女主角。1996年，与岩下志麻、玉置浩二一同出演的剧情片《雾的子午线》上映，吉永小百合在片中饰演纸雕艺术家泽田八重。
2000年，主演的爱情片《长崎漫步曲》上映，她在片中饰演万人仰慕的著名艺妓爱八，获得第24届日本电影学院奖最佳女主角奖、第42届日本电影蓝丝带奖的最佳女主角奖。
2001年，主演的改编自紫式部著小说《源氏物语》的传记片《千年之恋·源氏物语》上映，片中饰演女作家、家庭教师紫式部。
2005年，与渡边谦合作主演剧情片《北之零年》上映，在片中饰演小松原英明的妻子志乃，小百合凭借在片中的表演获第29届日本电影学院奖最佳女主角奖。
2008年，由山田洋次执导的家庭片《母亲》上映，小百合在片中饰演在战争中独自坚强抚养一双女儿的母亲佳代，凭着该片提名第32届日本电影学院奖最佳女主角、第3届亚洲电影大奖最佳女主角；同年，与竹中直人合作主演堤幸彦执导的剧情片《虚幻的邪马台国》。
2010年，主演的剧情片《弟弟》上映，吉永小百合在其中饰演温柔善良的高野吟子，并提名第34届日本电影学院奖最佳女主角。
2012年，在悬疑片《北方的金丝雀》中担任女主角，饰演美丽温柔的川岛春，并凭借该片获得第37届报知电影奖最佳女主角奖。
2014年，首次担当电影《不可思议的海岸物语》的制片人，并与阿部宽合作主演这部剧情片；该片获得第38届蒙特利尔国际电影节评委会大奖和普世教会评委会奖，而吉永小百合则凭借该片获得第57届蓝丝带电影奖最佳女主角奖。
2015年，与二宫和也携手主演的家庭片《如果和母亲一起生活》上映，两人在片中演绎母子情，吉永小百合并凭此片提名第39届日本电影学院奖最佳女主角。
2017年2月16日，主演泷田洋二郎执导的剧情片《北之樱守》，与堺雅人、筱原凉子合作，吉永小百合在其中饰演在残酷环境下带着两名儿子东奔西走并养大成人的母亲江莲铁，该片于2018年上映。
2019年，主演好莱坞经典电影日本翻拍版《遗愿清单》。2020年8月，出演电影《生命停车场》。
