2000年，张定涵与陈宝国、何赛飞、斯琴高娃合作出演家庭伦理剧《大宅门》，饰演杨九红的女儿白佳莉，而这也是她的首部影视剧作品。
2002年，出演周晓文执导的古装传奇剧《大脚马皇后》，饰演朱元璋的妃子宋敬妃，而这也是张定涵首次尝试古装扮相；同年，她还出演了张进战执导的年代情感剧《古城童话》。
2003年，搭档贾一平主演剧情片《大地起舞》，而这也是张定涵的首部电影作品；随后，她还出演了高群书执导的现代反腐剧《1.2亿》；12月，与苏有朋、蔡琳、赵雅芝合作出演古装武侠剧《杨门虎将》，在剧中饰演温柔可爱，心灵手巧的杨楚楚。
2004年，搭档寇世勋主演的家庭伦理剧《别在梦醒之前离开我》播出，饰演仲文的女友墨莉；5月，出演沈雷执导的悬疑商战剧《天下奇谋》播出；7月，与马景涛、宁静、胡静合作出演古装神话剧《魔界之龙珠》，饰演活泼可爱，古灵精怪的富家小姐上官飞燕。
2005年，与孙红雷、寇世勋合作出演年代抗战剧《刀锋1937》播出，饰演上海滩恶势力把持者虞中和的养女虞家茵。2007年，出演汪涛执导的亲情剧《非亲父子》，饰演爱恨分明的王若瑄。
2009年4月，与李宗翰、涓子、何建泽等合作出演王小康执导的家庭伦理剧《婚后三十年》，在剧中饰演性格泼辣，个性爽朗，刁蛮骄横的女一号苏蕾；12月，在康宁执导的年代情感剧《那些年那些事》中，饰演温文尔雅、秀丽大方的美女知青韩可可。
2010年，张定涵主演陈浩威执导的年代抗战剧《断箭》，饰演上海黑帮老大的女儿龙美君；9月，在赖水清执导的年代爱情剧《再见艳阳天》中饰演军中护士丁敏。
2012年7月，与钟汉良、陈楚河、张檬合作主演古装武侠爱情剧《天涯明月刀》在湖南卫视播出，在剧中饰演武林第一女诸葛，云天之巅的妙风使者明月心，该剧不仅收视率屡次破二，网络点击更是超过7亿次，创下多个视频网站电视剧播放量新纪录；同年，出演齐星执导的年代抗战剧《光荣大地》。2013年，张定涵领衔主演张辉力执导的古装武侠剧《新甘十九妹》，在剧中饰演心智过人、武功高超、重情义、遵师命的甘十九妹。
2014年，在范冰冰、张丰毅、李治廷主演的古装传奇剧《武媚娘传奇》中，张定涵一人饰演两个不同类型的角色，一个是贤良淑德，高贵大气的长孙皇后，另一个则是小家碧玉，楚楚动人的郑婉言。
2015年4月21日，参演的电视剧《铁甲舰上的男人们》播出。7月28日，与陈志朋领衔主演的爱情喜剧片《等爱归来》上映，在片中饰演聪明勇敢的文物鉴定家李晋楠。2016年，与孙坚、何琢言、海峰合作出演谍战剧《守卫者》，饰演国安局侦查处副处长景芸。
2017年2月23日，张定涵参加凤凰网直播栏目《大咖驾到》的录制；随后，与徐少强，李抒航合作出演古装爱情片《片甲不留》；5月，与许亚军、王琳合作主演都市情感剧《小重逢》，在剧中饰演甜美可人的美食节目主持人田天。8月，参演改编自匪我思存的同名小说的电视剧《东宫》，与先生王志飞及演员斯琴高娃、陈星旭、魏千翔等合作，饰演为权谋私、腹黑的张皇后；同年，参演古装剧《凰权弈天下》。
2018年7月，进组拍摄年代剧《一身孤注掷温柔》，饰演虞夫人。
2019年1月，参演以山东夏津特殊教育学校创建人袁敬华为人物原型的公益电影《朝华》，在片中饰演袁敬华，电影讲述了袁敬华对特教事业初心不改，对残疾孩子不离不弃，无私付出的感人故事。11月17日，参演的音乐剧场《真爱·梁祝》于上海首演，张定涵饰演萧珊。
2020年9月，参演的电视剧《最美逆行者》播出。
2021年3月8日，参演的电视剧《司藤》播出；7月1日，参加的庆祝中国共产党成立100周年文艺演出《伟大征程》播出，与黄渤、张嘉益、黄轩、闫妮、温玉娟、宋茜、王雷、范志博、许文广、刘诗诗、张奕聪、苏青、褚栓忠、杨斯等合作表演《小康之歌》。
